Jedes Analysezertifikat für ein Forschungspeptid trägt einen Reinheitsprozentsatz, und dieser Wert wird fast immer durch HPLC bestimmt. Dieser Leitfaden erklärt, was die Technik bewirkt, wie dieser Prozentsatz zustande kommt und – was am wichtigsten ist – was sie nicht aussagt.
HPLC trennt die Bestandteile einer Probe und exprimiert das Zielpeptid als Prozentsatz der gesamten Peakfläche. Es handelt sich also um ein Verhältnis, nicht um eine Abwägung: Restwasser und Gegenionen bleiben außer Sicht, und HPLC bestätigt dies nicht Identität des Moleküls.
Was ist HPLC?
HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) ist eine Trenntechnik, die die Bestandteile einer Probe auseinanderzieht und jede einzelne davon messbar macht. Die Probe wird gelöst und unter hohem Druck durch eine mit feinen Partikeln gefüllte Säule getrieben. Jede Komponente hat ihre eigene Affinität zu diesem Verpackungsmaterial und benötigt daher mehr oder weniger Zeit, bis sie am anderen Ende erscheint.
Am Ende der Säule sitzt ein Detektor. Es registriert, was wann passiert, und das Ergebnis ist ein Chromatogramm: eine Spur mit Peaks, wobei jeder Peak für eine Komponente steht, die zu diesem Zeitpunkt eluiert wurde.
Wie trennt HPLC eine Peptidprobe?
Für Peptide wird fast immer die Umkehrphasen-HPLC verwendet: eine unpolare Säule kombiniert mit einer wässrigen mobilen Phase, zu der nach und nach ein organisches Lösungsmittel hinzugefügt wird. Je hydrophober eine Komponente ist, desto länger bleibt sie auf der Säule und desto später wird sie eluiert. Diese Ankunftszeit wird Retentionszeit genannt.
Da sich die Zusammensetzung der mobilen Phase während des Laufs ändert – ein Gradient –, erscheinen Komponenten, die in ihrer Hydrophobie nahe beieinander liegen, immer noch als separate Peaks. Das ist genau das, was Sie von einem Peptid erwarten: Verwandte Nebenprodukte aus der Synthese ähneln stark dem Zielmolekül.
Woher kommt dieser Reinheitsprozentsatz?
Der Reinheitsprozentsatz ist ein Flächenprozentsatz: die Fläche des Peaks des Zielpeptids geteilt durch die Gesamtfläche aller Peaks. Bei Peptiden misst der Detektor typischerweise die UV-Absorption nahe 214 nm, der Wellenlänge, bei der die Peptidbindung selbst absorbiert – nützlich, weil dann jede peptidähnliche Komponente sichtbar ist, nicht nur diejenigen, die eine aromatische Aminosäure tragen.
Also 99,2 % auf a Zertifikat bedeutet: 99,2 % der Peakfläche gehörten dem Zielmolekül und 0,8 % etwas anderem. Wie man einen solchen Bericht liest, erfahren Sie in wie man ein Echtheitszertifikat liest.
Reinheit ist nicht dasselbe wie Peptidgehalt
Hier liegt die meiste Verwirrung: 99 % Reinheit bedeutet nicht, dass 99 % des Inhalts des Fläschchens aus Peptid besteht. Neben dem Molekül selbst enthält ein lyophilisiertes Peptid Restwasser und Gegenionen – häufig Trifluoressigsäure (TFA) oder Acetat aus der Peptidsynthese. Diese addieren sich zum Gewicht im Fläschchen, nicht aber zur Peakfläche im Chromatogramm.
Der Nettopeptidgehalt ist daher eine separate Bestimmung, die in einem Zertifikat enthalten sein kann oder nicht. Bei Forschungsarbeiten, bei denen es auf die genaue Menge einer Substanz ankommt, ist diese Zahl zu berücksichtigen – nicht der Reinheitsprozentsatz. Unsere eigenen Schwellenwerte sind aktiviert Qualitätsstandards.
Was HPLC Ihnen nicht verrät
HPLC quantifiziert, identifiziert aber nicht: Eine Retentionszeit stimmt mit einer Substanz überein, ohne zu beweisen, um welche Substanz es sich handelt. Das braucht Massenspektrometrie, das das Molekulargewicht misst und so die molekulare Identität bestätigt. Diese beiden Messungen zusammen bilden das Minimum für die Berücksichtigung einer charakterisierten Charge.
Und darüber hinaus: Eine Reinheitsmessung sagt nichts über Sterilität, Endotoxine oder Eignung für irgendeine Anwendung aus. Wer unsere Chargen misst und warum das ein Dritter ist, erfahren Sie hier Janoshik Analytical.
Diese Informationen sind allgemeiner und informativer Natur. LYSENTA liefert Forschungspeptide Nur für Labor- und Forschungszwecke. Nicht für den menschlichen oder tierischen Verzehr bestimmt, kein Arzneimittel und kein medizinischer Rat.
Häufig gestellte Fragen zur HPLC
Wofür steht HPLC?
HPLC steht für High-Performance Liquid Chromatography. Es handelt sich um eine Trenntechnik, bei der eine Probe unter hohem Druck durch eine Säule getrieben wird, sodass ihre Komponenten zu unterschiedlichen Zeitpunkten am anderen Ende ankommen und einzeln gemessen werden können.
Wie wird die Reinheit mittels HPLC bestimmt?
Aus der Fläche der Peaks im Chromatogramm. Die Fläche des Peaks des Zielpeptids wird als Prozentsatz der Gesamtfläche aller Peaks ausgedrückt. Bei 99,1 % auf einem Zertifikat handelt es sich also um einen Flächenprozentsatz und nicht um eine Gewichtsangabe.
Ist eine Reinheit von 99 % dasselbe wie 99 % Peptid im Fläschchen?
Nein. Die HPLC-Reinheit ist das Verhältnis zwischen dem Zielpeptid und anderen peptidbezogenen Komponenten, die der Detektor erkennt. Restwasser und Gegenionen aus der Synthese werden darin nicht berücksichtigt. Der Nettopeptidgehalt ist eine gesonderte Bestimmung.
Kann HPLC bestätigen, um welches Peptid es sich handelt?
Nicht allein. Eine Retentionszeit stimmt mit einem Stoff überein, beweist jedoch nicht dessen Identität. Dazu ist eine Massenspektrometrie erforderlich, die das Molekulargewicht misst. HPLC sagt wie viel, Massenspektrometrie sagt was.
